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过氧化物酶活性的测定实验报告,过氧化物酶pod活性测定实验报告

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1.过氧化物酶pod活性测定实验报告2.过氧化物酶活性的测定比色法3.过氧化物酶活性的测定实验报告总结与反思4.过氧化氢酶的测定

过氧化物酶pod活性测定实验报告

文章插图
过氧化物酶活性的测定比色法实验
48
过氧化物酶活性的测定（比色法）
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
一、原理
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在
470
nm
处有最大吸收，可用分光光度计测量
470
【?过氧化物酶活性的测定实验报告,过氧化物酶pod活性测定实验报告】nm
的吸光度变化测定过氧化物酶活性。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
马铃薯块茎。
（二）试剂
1
．
100
mmol
／
L
磷酸缓冲液
pH6.0
（见附录）。
2
．反应混合液：
100
mmol
／
L
磷酸缓冲液（
pH6.0
）
50
mL
于烧杯中，加入愈创木酚
28
μl
，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入
30
%
过氧化氢
19
μl
，混合均匀，保存于冰箱中。
（三）仪器设备
分光光度计，研钵，恒温水浴锅，
100
mL
容量瓶，吸管，
离心机。
三、实验步骤
1
．称取植物材料
1
g
，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以
4000
r
／
min
离心
15
min
，上清液转入
100
mL
容量瓶中，残渣再用
5
mL
磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。
2
．取光径
1
cm
比色杯
2
只，于
1
只中加入反应混合液
3
mL
和磷酸缓冲液
1mL
，作为对照，另
1
只中加入反应混合液
3
mL
和上述酶液
1mL
（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长
470
nm
下吸光度值，每隔
1min
读数一次。
四、结果计算
以每分钟吸光度变化值表示酶活性大?。?匆?
ΔA
470
/[min
?
g
（鲜重）
]
表示之。也可以用每
min
内
A
470
变化
0.01
为
1
个过氧化物酶活性单位（
u
）表示。
过氧化物酶活性
[u/
（
g
?
min
）
]=
式中：
Δ
A
470
——反应时间内吸光度的变化。
W
——植物鲜重，
g
。
V
T
——提取酶液总体积，
mL
。
V
s
——测定时取用酶液体积
,
mL
。
t
——反应时间，
min
。

文章插图
过氧化物酶活性的测定实验报告总结与反思影响酶活性的因素”是高中现行生物学课本中的一个实验内容，也是第1个探究性实验。但是，教材中所介绍的实验药品（α-淀粉酶）价格较贵，实验设计思路为定性实验。能否改进实验设计方案，使其不仅能培养学生的实验技能和实验设计能力，通过实验过程理解影响酶活性的因素的知识内容，而且促使学生积极参与探究活动，养成实事求是的科学态度和一丝不苟的科学探究精神呢？为此，笔者进行了一些有益的尝试。
1 实验设计
1．1 选用过氧化氢酶作为实验探究对象过氧化氢是细胞中某些化学反应的副产物，具有强氧化性，如果不及时除去或分解，就会杀死细胞。在动物的肝细胞和血细胞中含有较多的过氧化氢酶，它可以促进过氧化氢分解。由于过氧化氢酶容易获得且催化反应的现象明显，所以选用过氧化氢酶作为实验探究对象。
1．2 设备准备实验用具有：细胞培养瓶（代替反应小室）、刻度吸管、镊子、水槽、25 mL量筒；反应底物为30％H2O2，也可以用原包装双氧水配制的3％H2O2 ，但反应速度慢，现象不太明显，反应时间长。
实验中需要 H2O2酶滤纸片，制作方法是：将 10 g鲜肝剪碎，置于研钵中充分研磨，加入200 mL蒸馏水制成鲜肝液。然后，将滤纸剪成1 cm2的小片，平展在表面皿中，用鲜肝液浸泡l min后使用。
配制缓冲液，方法是：将17.96 g Na2HPO4·7H2O在 1 000 mL容量瓶内溶于蒸馏水中，加水至刻度，配制成0.067 mol／L Na2HPO4溶液。将9.07 g KH2PO4在1 000 mL容量瓶内溶于蒸馏水中，加水至刻度，配制成0.067 mol／L KH2PO4溶液。用上述两种溶液配制pH5、pH6、pH7、pH8缓冲液如下：
单位：mL
pH
5
6
7
8
0.067 mol／L KH2PO4
0.067 mol／L KH2PO4
1
99
20
80
60
40
95
5
1．3 实验方案参照美国BSCS教材中的实验方案，经过1个多月的摸索，改进原有实验装置，制定出简单易行且定量效果好的实验步骤如下：
l）向水槽中加水至将满为止。
2）将大小相同的8片滤纸片在鲜肝液中浸泡l min，然后用镊子夹起滤纸片，靠在培养皿壁上，使多余的酶液流尽。
3）用镊子将2片酶滤纸片小心地放入细胞培养瓶（用作反应小室）的一侧内壁上，使酶滤纸片粘在内壁上。注意滤纸片不要碰到反应小室的瓶口。
4）将细胞培养瓶立起，贴有酶滤纸片的一侧壁冲上，小心加入 pH＝5的缓冲液 2 mL ，然后再加入 2 mL 30％的H2O2溶液，切勿使上述混合液接触贴在内壁上的滤纸片。将小室塞紧。
5）将25 mL量筒横放于水槽中使之灌满水，若有气泡，将其轻轻倾斜，小心赶出气泡。将量筒倒立，使筒口一直处于水中。
6）小心将细胞培养瓶平放在水槽中的水里，注意反应小室贴有滤纸片的内壁应在上面，将量筒移至细胞培养瓶口上伸出的玻璃管上方，实验过程中要一直扶着量筒，保证量筒的位置不动。
7）将细胞培养瓶小心旋转180度，使H2O2溶液接触酶滤纸片。同时开始计时，在 30 S时，读取量筒水平面刻度并作出标记后记录。
8）反复冲洗反应小室后，重复上述实验过程，测量在 pH6、pH7、pH8时过氧化氢在酶的催化下所释放的气体量。注意：所有的实验中都要严格保证于净，不应该有上一次反应后的剩余溶液，每次试验完后，应充分冲洗，然后用相应的缓冲液再冲洗一遍。
2 教学过程
2．1 引入新课由上节课的实验操作引出本节课的实验内容，启发学生思考实验操作要达到的目的，为减少学生实验操作过程的盲目性做好铺垫。
学生作出温度和pH影响酶的活性的假设后，教师介绍本节课所用的酶和底物，以及过氧化氢酶在生物体内的分布情况。然后播放自制录像《pH过氧化氢酶活性的影响》，边看录像边讲解实验用具，但是不强调实验操作过程中的注意事项，意在训练学生的观察能力、对问题的敏感能力、综合分析能力。如果某一学生只是在被动地看录像而不是边看边思考，在自己具体实验过程中会遇到很多问题，使实验进程不顺利。而在看录像过程中积极思考的学生，实验每一步的操作应该注意的问题都会关注到，实验速度快且实验结果准确。
2．2 学生分组实验学生模仿录像中的操作进行自主实验，既需要分工合作，更需要在操作中发现问题并及时解决问题。这个过程中教师巡视学生的操作情况并适时地参与讨论，针对不同组的情况，提出一些小问题，引导学生进行深层次的思考。
实验中教师巡视，既可以了解学生实验的速度、实验过程中出现哪些不可预计的问题，使自己很好地驾驭课堂教学，又作为学习者参与讨论过程，营造宽松和谐的学习氛围。
2．3 交流和讨论实验结束后，教师请各组学生代表汇报实验结果，确定过氧化氢酶的最适pH，在交流过程中学生会发现不同组得出的实验结论可能有所不同。综合全班的实验结果，还是可以看出过氧化酶的最适宜pH是7 。然后教师告诉学生，科学家研究得出：肝脏中过氧化酶的最适pH是6.8，接近于7 。但是大家的实验结果各不相同，由此引出实验讨论的问题：实验过程中有哪些因素可能造成实验误差？学生针对自己的实验操作过程进行充分的讨论，总结出影响实验结果的一些因素。这是学生回忆实验操作进行自我反省和相互评价的过程，但是很少有学生对教师提供的实验方案表示质疑，为此教师又提出另外一个讨论题：你认为该实验设计中有哪些不完善的地方？应如何改进实验装置或方案，使实验结果更准确？一个小小的问题点燃了学生质疑的火花，大家各抒己见，提出改进实验方案的建议，学生的发散思维和创新思维在此体现得淋漓尽致。教师对学生的发言进行了充分的肯定，激发了学生的学习热情和积极性。因为实验步骤中只设计了pH为5－8的实验，所以教师又提出一个简单的问题：如果想得出不同的pH与酶活性关系的变化曲线，应该如何设计？由此引导学生思考实验目的不同，实验设计的步骤和方案可能有所不同，实验设计需要有针对性。
2．4 实验设计思路的迁移──设计并交流温度对酶活性影响的实验方案进行充分的讨论后，教师又提出问题：知道了不同的pH与酶活性的关系，现在请同学们设计“探究温度如何影响酶的活性”的实验方案。提醒学生注意底物和相应的实验装置的选择。给学生一段时间思考后，教师请学生交流实验方案。有的学生在教师提供的实验用具的基础上设计，有的学生利用化学中制备氢气的启普发生器作为反应体系，这样实验结果更加准确。但有的学生考虑得更加全面，想到H2O2在高温的情况下也会加速分解，用过氧化氢酶和H2O2探究温度的影响不太适合，所以改用淀粉作底物，唾液淀粉酶作催化剂。在这个交流过程中，学生相互评价实验的可行性，并且给予每组学生一些合理的建议。该过程充分体现了学生深入研究问题的能力。
3 教学小结和反思
生物科学实验中可以对学生进行探究过程的训练。包括观察、提出问题、进行假设、设计方案并进行实施、收集分析解读数据、得出合理结论、表达结果等。是学习者运用判断思维、逻辑思维进行学习的过程。在这个过程中，要很好地把握教师的主导作用和学生的主体作用，保证课堂教学的高效优质。避免出现盲目而无序，热闹而无获的情况。探究教学对教师驾驭课堂和教学内容的能力都提出了更高的要求。因此在授课前教师必须精心准备，要预见到可能发生的所有情况，尤其是实验安全性问题。
对实验结果的分析讨论和自主设计实验是本节课的重点，在这个过程中培养了学生多方面的能力：与他人的合作意识、分析综合的思维能力、表达与交流的能力、实事求是的科学态度、自我评价与评价他人的能力、创新能力等。但是能力的培养不是一朝一夕的事情，应该渗透到每堂课的教学中．渗透到教学的点点滴滴，朱意曾说过“读书无疑，需教有疑，有疑者无疑，至此方是长进”，在教学过程中，精心设问，周密安排，每堂课要给学生提供施展自己才华的舞台，长此以往，学生的各种能力会逐步得到提高乃至升华。
探究过程中教师应该注意自己扮演的是和学生平等的学习者而不是高高在上的知识的传授者，和学生共同探讨，可能从学生那里会获得更多的灵感和信息，反过来促进自己的教学。
如果时间允许，可以用2节课的时间，给学生提供必需的实验器材和用品，分组实施自己设计的“温度对酶活性的影响”方案，检验自己方案的可行性。这是一个自我价值的实现过程，相信在这一过程中更能激发学生学习生物学的热情，是培养学生学习生物学兴趣不可多得的契机。

文章插图
过氧化氢酶的测定你好?。?
使用过氧化氢酶检测试剂盒是比较简便的方法：
过氧化氢酶检测试剂盒(Catalase Assay Kit)是一种简单易行的通过显色反应来检测细胞、组织或其它样品中过氧化氢酶
(Catalase)活性的试剂盒。在过氧化氢相对比较充足的情况下，过氧化氢酶可以催化过氧化氢产生水和氧气。残余的过氧化
氢在过氧化物酶(Peroxidase)的催化下可以氧化生色底物，产生红色的产物(N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-p-
benzoquinonemonoimine)，最大吸收波长为520nm 。用过氧化氢标准品，制作标准曲线，这样就可以计算出样品中的过氧化氢
酶在单位时间单位体积内催化了多少量的过氧化氢转变为水和氧气，从而可以计算出样品中过氧化氢酶的酶活力。
? 过氧化氢酶分布非常广泛。在肝脏、肾脏和红细胞中，过氧化氢酶的水平非常高，这些器官和细胞是清除能导致氧化损伤的过氧
化氢的主要场所。
? 过氧化氢酶的活性也可以用紫外分光光度计测定A240，但蛋白质或其它组份在A240附近都有比较强的吸收，会对测定产生严重干
扰。因此，用紫外法测定过氧化氢酶的活性，比较适合纯化的过氧化氢酶。本试剂盒通过检测A520来测定过氧化物酶催化下由过
氧化氢氧化生色底物产生的红色产物，受干扰的因素?。?检测灵敏度高，可以检测出低达1U/ml的过氧化氢酶。
? 本试剂盒可以检测全血、红细胞裂解产物、血清、组织匀浆产物、细胞裂解产物等生物样品中的过氧化氢酶的活性。一个试剂盒
共可以进行100次检测。
使用方法：
配制250mM过氧化氢溶液。本试剂盒提供的过氧化氢浓度约为1M 。由于过氧化氢不是非常稳定，使用前需自行测定过氧化氢的
实际浓度。把浓度约为1M的过氧化氢用本试剂盒提供的过氧化氢酶检测缓冲液稀释100倍，使过氧化氢的浓度约为10mM 。测定
A240 。
过氧化氢(mM)=22.94XA240
从而计算出本试剂盒提供的过氧化氢的实际浓度。然后再根据实际的过氧化氢浓度配制250mM过氧化氢溶液。
b. 配制5mM过氧化氢溶液。根据测定得到的实际过氧化氢浓度配制5mM过氧化氢溶液。
c. 配制显色工作液。在冰浴上溶解显色底物，适当分装后再使用，尽量避免反复冻融。其它试剂放置在冰浴上备用。取适当量的过
氧化物酶，按照1:1000的比例用显色底物稀释，配制成显色工作液。例如取5微升过氧化氢酶，加入5ml显色底物，混匀即得到
5ml显色工作液。
2. 样品的准备：
用适当的裂解液裂解细胞或组织(可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液进行裂解) 。用本试剂盒提供的过氧化氢酶检测
缓冲液稀释样品，裂解好的样品至少加入等体积的过氧化氢酶检测缓冲液进行稀释。具体的稀释倍数可以参考表1 。

文章插图
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